Ensayo espectrofotométrico por pNPP

Aquí hay una serie de preguntas relacionadas que quiero preguntar. Si usted piensa que deberían ser diferentes preguntas, por favor dígame so.Background La actividad de la fosfatasa ácida se mide por una reacción enzimática que convierte el fosfato pnitrophenyl (pNPP) a p-nitrofenol (PNP), liberando fosfato. El producto, PNP, absorbe la luz cuya longitud de onda es de 400 nm con un coeficiente de absorción (400 nm) de 19.000 M-1 cm-1 a pH muy alcalino. La mezcla de reacción para una fosfatasa ácida es ligeramente ácida. Por lo tanto, debe ser alcaliniza para la cuantificación de pNP. Dos concentraciones de la enzima se han de examinar - (. La enzima 0,1 X se hace mezclando 1 ml de enzima 1X en 9 ml de NaCl) Son 1X y 0,1 X Los tiempos de reacción para cada enzima es de 1,10 y 20 Protocolo para la medición minutes.Procedure de ácido actividad de la fosfatasa 1) Mezclar 0,12 ml de tampón de acetato de Na 0,5 M (pH 5,6) y 0,24 ml de 5 mM de pNPP en un tubo de ensayo. Iniciar la reacción mediante la adición de 0,24 ml de una solución de enzima. 2) Después de los tiempos de reacción de 1, 10, y 20 min, respectivamente, detener la reacción mediante la adición de 0,6 ml de 0,5 M de NaOH. NaOH se detiene la reacción y convierte la pNP produce en una forma de color amarillo (A400-absorbente). 3) Después se detienen todas las reacciones, medir A400 del samplesThere son algunas de las cosas que se supone debo calcular después obtengo el results.First voy a trazar un gráfico de absorbancia frente a tiempo y encontrar la pendiente de cada uno de la línea. ( ) Ahora me han preguntado 1X y 0,1 X para encontrar absorbancia change/min/1ml de respuesta 1X enzyme.My: Divida la pendiente obtenida por 0,24 (la cantidad de enzima) que viene tengo que convertir el cambio de absorbancia a cambio de concentración cuando L es 1cm y e400 de pNP es la respuesta 19000/M/cm.My: Esto se puede encontrar a cabo por A = ECL La siguiente pregunta es para convertir el cambio de concentración a un cambio en el número de moles de respuesta pNP.My: No tengo ni idea de cómo hacer esto! Por último, tengo que calcular la actividad total (en moles por minuto) en 4 ml de solución 1X enzima solution.My: Multiplique la respuesta que obtengo en la pregunta anterior por 4.Thanks para sobrevivir a ella hasta aquí :)